Категория
Биология
Тип
курсовая работа
Страницы
84 стр.
Дата
01.03.2013
Формат файла
.doc — Microsoft Word
Архив
160229.zip — 65.69 kb
  • produkty-rekombinacii-xarakteristika-i-manipulirovanie_160229_1.doc — 260.5 Kb
  • Readme_docus.me.txt — 125 Bytes
Оцените работу
Хорошо  или  Плохо


Текст работы

Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование

После отбора клонированных рекомбинантных молекул нужно
охарактеризовать содержащуюся в них вставку. Для этого необходимо ответить на
несколько вопросов. Прежде всего - действительно ли рекомбинантная молекула
содержит нужный сегмент ДНК? Далее - включился ли сегмент целиком или только
частично? Соответствует ли он во всех деталях геномной ДНК, из которой
происходит? Является ли нужная последовательность функциональной? Мы рассмотрим
разные подходы к характеризации клонированных фрагментов ДНК. Прежде всего
нужно очистить рекомбинантную ДНК от ДНК клеток хозяина, РНК и белков. Эта
процедура довольно проста и включает экстракцию, физическое разделение
компонентов и ферментативное расщепление РНК и белков. Так, плазмидную ДНК
можно отделить от геномной благодаря ее малому размеру и кольцевой структуре. Фаговую
ДНК можно получить в свободном от клеточной ДНК виде путем очистки фаговых
частиц и последующего выделения из них ДНК.

макроструктура клонированной вставки

Для определения макроструктуры вставки сначала устанавливают
ее размер и положение сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз. Поскольку
клонированные фрагменты геномной ДНК часто бывают длиннее или короче, чем
интересующая нас область, необходимо также определить положение и длину нужного
сегмента внутри вставки.

а. Размер вставки

Размер векторной молекулы обычно бывает известен, поэтому
размер вставки можно оценить, зная полную длину рекомбинантной молекулы и
предположив, что никакого делетирования во время клонирования не произошло. Размер
многих рекомбинантных молекул можно определить с помощью гель-электрофореза. Чтобы
получить точные данные, кольцевые рекомбинантные молекулы превращают в
линейные, поскольку электрофоретическая подвижность кольцевых структур зависит
от степени их сверхспиральности. Стандартные электрофоретические методы
непригодны для тестирования молекул, длина которых превышает 15 т.п. н,
поскольку крупные молекулы мигрируют в геле слишком медленно. Поэтому размер
многих рекомбинантных молекул не поддается прямому определению с помощью электрофореза,
если только не используется импульсный электрофорез. Альтернативный способ
оценки размера рекомбинантных молекул состоит в измерении их длины с помощью
электронной микроскопии. Здесь тоже очень важны стандартные размеры, поскольку
число пар оснований в сегменте определенной длины на электронной
микрофотографии может зависеть от конфигурации молекулы и способа приготовления
препарата.



Ваше мнение



CAPTCHA